發(fā)表者：北京博奧森生物 發(fā)表時間：2016-2-15
免疫電鏡是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶有負電的性質(zhì)，使其與抗體相吸附，從而將抗體標記。當用金標記的抗體與抗原反應(yīng)時，在光鏡水平膠金液呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色，不需加外進行染色。在電鏡水平，金顆粒具有很高的電子密度，清晰可辨。因此，免疫電鏡膠體金標記法近年來被成功地應(yīng)用于生物學(xué)的各個方面，并取得了長足的進展，解決了一些過去未能解決的問題，80年代以來似有取代免疫電鏡PAP技術(shù)的趨勢。膠體金標記抗體技術(shù)在電鏡水平應(yīng)用有許多優(yōu)點：而 PAP法則煩瑣的多，膠體金法不需用H2O2等損傷微細結(jié)構(gòu)的處理步驟，對微細結(jié)構(gòu)的影響較少。其次，金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易于與其他免疫產(chǎn)物相區(qū)別。
因此，金標法還可以和PAP法相結(jié)合進行雙重或多重染色的超微結(jié)構(gòu)定位。另外，利用不同直徑的金顆粒標記不同的抗體，是研究突觸小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)共存的有力工具。由于抗原抗體反應(yīng)部位結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少可進行粗略的免疫細胞化學(xué)定量研究。金標抗體還可加入培養(yǎng)液中，對培養(yǎng)細胞內(nèi)抗原進行標記定位。曾有報告用金標記法于細胞內(nèi)骨架的研究獲滿意的效果。由于金具有強烈的繼發(fā)電子的能力，因此，不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表面的抗原、受體進行標記定位觀察。金標液無毒性，對人體無損傷。 在原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用中，膠體金的標記術(shù)被科技工作者認為是當前最理想的標記物。
電鏡水平的免疫金染色法
應(yīng)用于電鏡水平的免疫法，可分為包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色對細胞膜的穿透性差，一般只用于細胞表面的抗原標記，如需穿透細胞膜，則需輔以凍融法或加入Triton X—100、皂素等活性劑，后者會加重細胞超微結(jié)構(gòu)的破壞，因此，現(xiàn)較普遍采用包埋后染色，現(xiàn)分別介紹如下：
1．包埋后染色
（1）超薄切片厚50～70nm左右，載于200～300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。
（2）置1%H2O2內(nèi)10min至1h（視樹脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片，有主張以1%過碘酸鉀（KIO4）代替H2O2的。
（3）雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次洗法如（2），浮于液滴上，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當壓力，但不宜過高強，用濾紙在網(wǎng)緣將水吸干。
（4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）滴上，室溫30～60min，以飽和固定劑中的游離醛基占據(jù)非特異性結(jié)合部位。
（5）PBS漂洗3min，洗1次（有人主張不洗）。
（6）濾紙吸干，孵育于第一抗體血清滴上，先室溫預(yù)孵1h，再置于4℃ 24～36h。
（7）PBS漂洗3min，3次。
（8）PBS（內(nèi)含1%的牛血清白蛋白）pH8.2中，5min，此步為膠體金結(jié)合作準備。
（9）膠體金標記抗體液1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育10min至1h。
（10）雙蒸水洗3min，3次。
如作雙重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復(fù)上述步驟（2）～（10）。
（11）5%醋酸鈾（雙蒸水配制）染5min，然后用雙蒸水洗。
（12）枸櫞酸鈾（或醋酸鉛）染色5min，雙蒸水洗凈。
（13）電鏡觀察。
2．包埋前染色
（1）組織經(jīng)過適當固定，為增強細胞穿透性，可在固定液中加入皂角素（Saponin），使其濃度為0.01%，經(jīng)含皂角認固定劑處理5～8min后，應(yīng)用0.01mol/L PBS Ph7.4沖洗12h左右，中間換洗3～4次。
（2）組織切片貼于明膠涂抹的坡片上，細胞可制成混懸液，用離心法操作或制成涂片。
（3）0.05mol/L PBS pH7.4洗3min。
（4）以1：5正常羊血清處理切片30min室溫，以阻斷非特異性吸附。
（5）第一抗體4℃孵育20h后室溫2h或過夜。
（6）0.05mol/L TBS pH7.4洗3min×3。
（7）0.02mol/L TBS pH8.2洗3min×3，為與膠體金結(jié)合作準備。
（8）再次阻斷非特異性吸附，同（4）。
（9）以金標記的第二抗體（工作濃度1：40左右）在室溫下孵育1h。
（10）0.05mol/L TBS pH8.2洗3min。
（11）0.05mol/L TBS pH7.4洗3min×3
（12）1%鋨酸（0.1mol/L PBS溶液）1h。
（13）雙蒸水洗15min。
（14）系列酒精或丙酮脫水，包埋、超薄切片。（15）枸椽酸鉛對照染色。
為增加抗非特異性染色，有的實驗室傾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma）。理想的免疫金染色切片，背景應(yīng)清潔，無殘留的金或其他無機鹽顆粒，金粒集中在抗原、抗體反應(yīng)部位。要獲得理想的免疫金染色切片，需注意的因素很多，其中主要的如：①抗體血清的高度特異性和親和力；②被檢組織應(yīng)有較高濃度的抗原；③沖洗液的清潔度，沖洗的徹底程度以及整個過程中應(yīng)用的各種器皿的清潔度等；④所有溶液最好用微孔濾過器（milipore filter濾過），濾膜孔徑0.2～0.45μm，所有器皿應(yīng)清潔和專用。整個操作過程應(yīng)在濕盒內(nèi)進行，以使載網(wǎng)保持濕潤。
北京博奧森生物技術(shù)公司-蛋白標記室
